MALDI Imaging Probenvorbereitung

KRISTALLGRÖSSE DER MATRIXSCHICHT BEI MALDI IMAGING

Um einen Laserdurchmesser von 1 µm zu realisieren, braucht man eine Kristallgröße von 100-200 nm. SunChrom ist es gelungen, die Kristallgröße von 1 µm, die bisher nur durch Sublimationsverfahren erreichbar war, durch Optimierung der Sprayprozedur und des Spraykopfes signifikant nach unten auf bis zu 200 nm zu verkleinern. Damit ist der Weg frei für Laser mit bis zu 1 µm Durchmesser und mit einer effektiven Auflösung bis zu 1 µm. Hiermit wird der Weg zu einer Einzel-Zell-Analyse eröffnet.

DERZEIT KLEINSTE MALDI MATRIXKRISTALLE WELTWEIT !

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Die Probenvorbereitung für MALDI Imaging ist oft der erste limitierende Faktor für eine örtliche Auflösung. Einfluss auf das Ergebnis haben z.B. die Kristallgröße und die Homogenität der Matrixschicht sowie die unerwünschte Wanderung/Diffusion der Analyten. Die diffusionsbedingte Wanderung der Analyten kann vor oder während der Beschichtung mit der Matrix erfolgen. Müssen nämlich vor dem Auftragen der Matrix die Lipide aus dem Gewebe „herausgewaschen“ werden und dies erfolgt nicht schnell und effizient genug, geht die Ortsauflösung verloren. Wir gehen hier nicht darauf ein wie die gefrorenen oder FFPE-Proben geschnitten und auf Glas- oder Metalltargets fixiert werden. Vielmehr werden wir uns auf die Matrix- und/oder Enzymbeschichtung der Gewebeproben beschränken. Die Matrices werden in wässrig-organischen Lösungsmitteln gelöst aufgetragen. Bleiben punktuelle oder flächenartige Bereiche zu lange feucht bzw. nass, geht meistens bei jeder Lage bzw. bei jedem Auftrag ein gewisses Maß an Auflösung verloren, indem die Analyten ihre ursprüngliche Position verlieren. Die diffusionsbedingte Wanderung ist umso größer,
  • je kleiner der Analyt ist. So sind kleinere Peptide davon mehr betroffen als größere Proteine.
  • je löslicher der Analyt in dem verwendeten Lösungsmittel ist. Proteine in reinem Ethanol sind viel weniger gefährdet als kleinere Peptide oder Pharmaka in wässrig-organischen Lösungsmitteln.
  • je höher die Temperatur und je kleiner die Viskosität des Lösungsmittels ist.

OPTIMIERTE SPRAYPROZEDUR: KRISTALLE IN MATRICES MIT 100-200 NM !

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METHODEN DER MALDI IMAGING PROBENVORBEREITUNG

Auftragsmethoden für die Matrices

Die Auftragsmethode richtet sich nach den Analyten, die man untersuchen oder nachweisen möchte. So benötigen schwer verdampfbare oder Bio-Moleküle eine Extraktion und den Einbau in die Kristallstruktur der Matrix. Andere Verbindungen wie Lipide brauchen als leicht verdampfbare Stoffe nur eine Beschichtung ohne Extraktion.

TLC-Spray bzw. manuelle Sprühmethode
Matrixbeschichtung mit einem TLC-Sprayer
Matrixbeschichtung mit einem TLC-Sprayer

Dieses leicht anwendbare und sehr preisgünstige Verfahren erfordert viel Erfahrung, um eine homogene Beschichtung zu erzielen. Trotzdem ist die Tropfengröße äußerst inhomogen (siehe Abb.). Diese Methode eignet sich nicht für eine Einzel-Zell-Analyse. Die sog. Airbrush-Pistolen ergeben deutlich bessere Ergebnisse; die Homogenität der Schichten erfordert Erfahrung und ändert sich stark von Tag zu Tag sowie abhängig von dem Lösungsmittelgemisch. Außerdem wird von Kupfer-Addukten berichtet, die vom verwendeten Messing-Material der Airbrush-Pistolen herrühren. Nachteilig ist die inhomogene Beschichtung mit sehr unterschiedlicher Tropfengröße.

Mikro-Spotting-Technik

Die Mikro-Spotting-Technik bringt Pikoliter große Tropfen auf die Gewebeoberfläche. Es wird oft von verstopften Düsen berichtet, wenn konzentrierte Matrixlösungen verwendet werden. Der Spotdurchmesser beträgt ca. 150 µm und die Spotabstände bewegen sich zwischen 20-250 µm. Diese Zahlen verdeutlichen, dass diese Technik nicht für eine Einzel-Zell-Analyse verwendet werden kann, da die maximale Auflösung nicht unter 200 µm sein kann. Ob die Extraktion einer solch kleinen Flüssigkeitsmenge für die Proteine oder Peptide optimal ausreicht, muss herausgefunden werden. Ein zusätzliches Problem entsteht, wenn auf die vorherigen Spots weitere Tropfen appliziert werden, die nicht gleichmäßig abdeckend aufeinander platziert werden können, wodurch sich die Auflösung weiter verschlechtert. Die Vertreter dieser Methode sind Portrait® (Labcyte Inc., USA) und ChIP-1000® (Shimadzu Corp. Japan)

Ultraschallsprüher

Ultraschallsprüher erzeugen aus einer Matrixlösung feine, in der Größe unterschiedliche Tröpfchen, die in einer Kammer niedergehen. Jede Lage wird anschließend mit einem Stickstoffstrom getrocknet. Eine Streudetektion bestimmt, ob die Beschichtung ausreichend ist. Nachteil dieser Methode ist, dass die Tropfen unterschiedlich niedergehen und somit die Größenverteilung innerhalb der Sprühkammer sehr inhomogen ausfällt. Die Beschichtungsdicke bzw. –konzentration ist ebenfalls in Entfernung zur Sprühquelle unterschiedlich. Durch die Wartezeiten zur Trocknung zwischen den Sprühschichten und durch die erforderliche sehr hoheAnzahl von Schichten kann die Beschichtungsdauer einige Stunden in Anspruch nehmen; ImagePrep® (Bruker Daltonics; Deutschland)

Modifizierte Airbrush-Methode

Die modifizierte Airbrush-Methode mit einem optimierten Sprühkopf für sehr kleine Matrixdosagen wird von zwei Herstellern angeboten. Die Geräte „atomisieren“ die Flüssigkeit mit Hilfe von Druckluft oder Stickstoff in sehr kleine Tröpfchen. Beide Geräte bewegen den Sprühkopf über eine programmierbare Gewebefläche. Dadurch ergibt sich ein sehr homogener Matrixauftrag. Eines der Geräte kann sogar den Matrixstrom heizen, wodurch die Matrixkonzentration im Sprühnebel erhöht wird. Dies kann bei CHCA erforderlich sein, da die Löslichkeit von CHCA in ACN/Wasser-Gemischen max. 16 mg/mL beträgt. Ein weiterer Unterschied zwischen den beiden Geräten ist die Präzision der Matrixdosage und der Verbrauch der Matrix bzw. Enzymlösungen. Eine moderne Spritzenpumpe der SunChrom-Anlage reduziert den Verbrauch erheblich, wobei die Präzision der Dosage bis in den Bereich von Pikoliter/Minute exzellent bleibt. Die Extraktionseffizienz ist gerade bei Biomolekülen hervorragend; die Auftragsgeschwindigkeit beträgt Minuten anstatt Stunden. HTX-Sprayer® (HTX Technologies, LLC, USA) und SunCollect® (SunChrom GmbH, Germany)

Elektrospray-Technik

Bei der Elektrospray-Technik wird die Matrixlösung über eine Spraynadel gesprüht, wobei zwischen Nadel und Target ein elektrisches Feld aufgebaut wird. Diese Methode kann auch für Peptide/Proteine angewendet werden. Eine gleichbleibende Potentialdifferenz zwischen Sprühnadel und Trägerplatte bzw. Gewebe ist essentiell. Auch eine gleichbleibende Trocknung kann Probleme verursachen wie von einigen Autoren berichtet wird.

Sublimation

Sublimation erzeugt neben erheblich kleinerer Kristallgröße auch eine homogene Beschichtung. Die Matrix wird dabei automatisch gereinigt. Da die Matrix direkt aus der Gasphase auf dem Gewebe als Feststoff kristallisiert, findet keine Extraktion statt; es handelt sich um eine vom Gewebe unabhängige Matrix-Schicht. Aus diesem Grund ist diese Methode nur auf wenige Analyten wie z.B. Lipide sowie leicht verdampfbare Kleinmoleküle anwendbar. Die Analyten werden nicht in die Matrixkristalle eingebaut und Peptide/Proteine sind durch diese Methode nicht zugänglich. Der apparative Aufwand sowie der Zeitaufwand ist relativ gering. Auch hier wird eine komplette Fläche mit Matrix überzogen; eine gezielte Beschichtung ist nicht möglich und der Matrixverbrauch ist relativ hoch. Nur einige wenige Matrices eignen sich für diese Methode wie z.B. DHB (150 °C); CHCA (170 °C) sowie DAN. Mit anderen Matrices oder Enzymlösungen ist diese Methode nicht anwendbar.

Sublimation/Rekristallisation

Sublimation/Rekristallisation unter einer feuchten Atmosphäre versucht der Limitierung der Sublimationsmethode in Bezug auf Extraktion entgegen zu wirken. Die durch Sublimation beschichteten Objekte werden in einer mit Wasser gesättigten Umgebung 24-72 Stunden aufbewahrt, wobei durch die Feuchtigkeit eine gewisses Maß an Extraktion stattfindet. Nachteil dieser Methode ist die extrem lange Dauer der Probenvorbereitung.

SUNCOLLECT SYSTEM FÜR MALDI IMAGING